| Titre : | Résistance aux antibiotiques et biofilm des bactéries à Gram négatif de viande hachée bovine : potentiel des bactériophages locaux |
| Auteurs : | KAID Mokhtaria Amira, Auteur ; AOUIMEUR Khadidja Chahinez, Auteur ; BENABBOU Taha Ahmed, Directeur de thèse |
| Type de document : | texte imprimé |
| Editeur : | Dr. Moulay Tahar Université Saida, Faculté des Sciences Naturelles et de la Vie, 2025/2026 |
| Format : | 130 p / 29 CM |
| Accompagnement : | CD |
| Langues: | Français |
| Langues originales: | Français |
| Catégories : | |
| Mots-clés: | Bactéries à Gram négatif ; viande hachée bovine ; résistance aux antibiotiques ; multirésistance (MDR) ; biofilm ; cristal violet ; bactériophages ; phagothérapie ; Saïda ; Algérie |
| Résumé : |
Cette étude vise à caractériser les bactéries à Gram négatif isolées de viande
hachée bovine commercialisée dans trois boucheries de la commune d'Aïn El Hadjar (wilaya de Saïda, Algérie), en évaluant leur profil de résistance aux antibiotiques, leur capacité de formation de biofilm et la potentialité des bactériophages comme alternative aux antibiotiques. Au total, 30 souches ont été isolées sur milieu MacConkey à partir de trois échantillons présentant des charges bactériennes allant de 1,44 × 10⁵ à 5,85 × 10⁶ UFC/g, dépassant les seuils réglementaires fixés par le Règlement CE n°2073/2005. L'identification biochimique a orienté les isolats vers les genres Escherichia, Shigella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Hafnia et Aeromonas. L'antibiogramme, réalisé sur 24 souches selon les recommandations du CLSI (2025), a révélé une résistance universelle à l'amoxicilline-acide clavulanique (100%), une résistance majoritaire à la pénicilline G (100%) et au cotrimoxazole (54,2%), et une sensibilité totale à la gentamicine (100%). L'analyse statistique par le test de Kruskal-Wallis a mis en évidence une différence significative de la distribution des profils de multirésistance (MDR) entre boucheries (H = 8,770 ; p = 0,012, avec un niveau de résistance significativement plus élevé dans la boucherie KD. L'évaluation de la formation de biofilm par cristal violet (microplaque 96 puits, méthode de Stepanović et al., 2007) a révélé que 80% des souches étaient productrices de biofilm, dont 16,7% fortes productrices. Des bactériophages isolés d'eaux usées locales ont démontré une activité lytique significative sur trois souches représentatives, avec des taux de réduction de la croissance bactérienne de 62,5 à 75,9% en cinétique microplaque (DO₆₀₀ nm, 4h et 24h). L'activité antibiofilm, évaluée par cristal violet après 18h d'incubation, n'a pas atteint le seuil de significativité statistique. Ces résultats soulignent la nécessité d'une surveillance renforcée de la résistance aux antibiotiques dans la chaîne alimentaire et confirment le potentiel des bactériophages comme agents de biocontrôle dans un cadre "One Health". |
| Note de contenu : |
Table des matières
Liste des abréviations .............................................................................................................i Liste des tableaux .................................................................................................................iii Liste des figures....................................................................................................................iv Résumé ................................................................................................................................vii Abstract...............................................................................................................................viii ملخص....................................................................................................................................ix Table des matières................................................................................................................. x PARTIE I. INTRODUCTION ........................................................................................... 1 PARTIE II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .............................................................. 6 II.1. GENERALITES SUR LA VIANDE HACHEE BOVINE ET LES ENTEROBACTERIES .............. 7 II.1.1. VIANDE HACHEE BOVINE .............................................................................................. 7 II.1.1.1. Définition ................................................................................................................. 7 II.1.1.2. Impact du hachage sur la contamination.................................................................. 7 II.1.1.3. Conditions d’évolution des germes.......................................................................... 8 II.1.1.3.1. Facteurs intrinsèques............................................................................................. 8 II.1.1.3.1.1. Nutriments ......................................................................................................... 8 II.1.1.3.1.2. pH....................................................................................................................... 8 II.1.1.3.1.3. Activité de l’eau................................................................................................. 9 II.1.1.3.2. Facteurs extrinsèques............................................................................................ 9 II.1.1.3.2.1. Température ....................................................................................................... 9 II.1.1.3.2.2. Contamination initiale........................................................................................ 9 II.1.1.4. Principaux germes contaminant la viande hachée ................................................... 9 II.1.1.4.1. Flore saprophyte.................................................................................................... 9 II.1.1.4.1.1. Flore aérobie mésophile................................................................................... 10 II.1.1.4.1.2. Levures............................................................................................................. 10 II.1.1.4.1.3. Moisissures ...................................................................................................... 10 II.1.1.4.2. Flore pathogène :................................................................................................. 10 II.1.1.4.2.1. Escherichia coli (EHEC) ................................................................................. 10 II.1.1.4.2.2. Salmonella ....................................................................................................... 11 II.1.1.4.2.3. Staphylococcus aureus..................................................................................... 11 Table des matières xi II.2. GENERALITES SUR LES ENTEROBACTERIES ............................................................... 12 II.2.1. HISTORIQUE ............................................................................................................... 12 II.2.2. DEFINITION ................................................................................................................ 12 II.2.3. HABITAT .................................................................................................................... 13 II.2.4. TAXONOMIE ............................................................................................................... 13 II.2.5. CARACTERE BACTERIOLOGIQUE................................................................................. 14 II.2.5.1. Caractère morphologique....................................................................................... 14 II.2.5.2. caractères culturaux ............................................................................................... 14 II.2.5.3. Caractère antigénique............................................................................................. 15 II.2.5.4. Caractère biochimique ........................................................................................... 16 II.2.6. POUVOIR PATHOGENE................................................................................................ 17 II.3. ANTIBIOTIQUES ET ANTIBIORESISTANCE ................................................................... 18 II.3.1. ANTIBIOTIQUES.......................................................................................................... 18 II.3.1.1. Historique............................................................................................................... 18 II.3.1.2. Définition ............................................................................................................... 19 II.3.1.3. Mode d’action ........................................................................................................ 20 II.3.1.4. Classification des antibiotiques ............................................................................. 21 II.3.1.4.1. Critère de classification....................................................................................... 21 II.3.2. ANTIBIORESISTANCE.................................................................................................. 22 II.3.2.1. Définition de antibiorésistance .............................................................................. 22 II.3.2.2. Types de résistance aux antibiotiques.................................................................... 23 II.3.2.2.1. Résistance naturelle ............................................................................................ 23 II.3.2.2.2. Résistance acquise .............................................................................................. 23 II.3.2.3. Mécanisme de la résistance.................................................................................... 23 II.3.2.3.1. Inactivation enzymatique de l’antibiotique......................................................... 23 II.3.2.3.2. Modification de la cible ...................................................................................... 24 II.3.2.3.3. Imperméabilité membranaire .............................................................................. 24 II.3.2.3.4. Efflux actif .......................................................................................................... 24 II.4. BIOFILM....................................................................................................................... 24 II.4.1. HISTORIQUE ............................................................................................................... 24 II.4.2. DEFINITION ................................................................................................................ 25 II.4.3. MECANISMES DE FORMATION D’UN BIOFILM BACTERIEN ........................................... 26 II.4.3.1. Adhésion réversible ............................................................................................... 27 II.4.3.2. Adhésion irréversible ............................................................................................. 28 Table des matières xii II.4.3.3. Formation de micro-colonies................................................................................. 28 II.4.3.4. Maturation de biofilm ............................................................................................ 28 II.4.3.5. Dispersion .............................................................................................................. 28 II.4.4. FACTEURS FAVORISANT LA FORMATION D’UN BIOFILM.............................................. 29 II.4.4.1. Propriétés de la surface .......................................................................................... 29 II.4.4.1.1. Rugosité .............................................................................................................. 29 II.4.4.1.2. Caractéristiques chimiques d’une surface........................................................... 29 II.4.4.1.3. Présence préalable de films protéiques............................................................... 29 II.4.4.2. Propriétés du milieu ............................................................................................... 30 II.4.4.3. Caractéristiques des microorganismes................................................................... 30 II.4.5. QUORUM SENSING ET REGULATION DE LA FORMATION DE BIOFILM ........................... 30 II.4.6. EFFETS BENEFIQUES ET NEFASTES DE BIOFILMS ......................................................... 31 II.4.6.1. Biofilms bénéfiques............................................................................................... 31 II.4.6.2. Effets néfastes des biofilms ................................................................................... 31 PARTIE III. MATERIEL ET METHODES.................................................................... 33 III.1. MATERIEL ET METHODES.......................................................................................... 34 III.1.1. OBJECTIF DE L’ETUDE............................................................................................... 34 III.1.2. LIEU ET PERIODE D’ETUDE ........................................................................................ 34 III.1.3. PREPARATION ET ISOLEMENT BACTERIEN ................................................................. 34 III.1.3.1. Suspension de la solution mère et les dilutions décimales................................... 34 III.1.3.1.1. Suspension mère ................................................................................................ 34 III.1.3.1.2. Préparation des dilutions ................................................................................... 34 III.1.4. ENSEMENCEMENT..................................................................................................... 35 III.1.5. EXAMEN MACROSCOPIQUE ....................................................................................... 35 III.1.6. PURIFICATION DES BACTERIES .................................................................................. 35 III.1.7. OBSERVATION MICROSCOPIQUE................................................................................ 36 III.1.8. CONSERVATION DES ISOLATS.................................................................................... 36 III.1.8.1. Conservation à court terme................................................................................... 36 III.1.8.2. Conservation à long terme.................................................................................... 36 III.1.9. IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE.................................................................................. 37 III.1.9.1. Recherche de l’oxydase ........................................................................................ 37 III.1.9.2. Recherche de la catalase ....................................................................................... 38 Table des matières xiii III.1.9.3. Test de l'indole...................................................................................................... 38 III.1.9.4. Test du Rouge de Méthyle (RM).......................................................................... 39 III.1.9.5. Test de Voges-Proskauer (VP) ............................................................................. 39 III.1.9.6. Citrate de Simmons .............................................................................................. 39 III.1.9.7. Mannitol mobilité ................................................................................................. 39 III.1.10. IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE PAR LES SYSTEMES API 20E ET API 10S................ 40 III.1.10.1. Préparation de la galerie ..................................................................................... 40 III.1.10.2. Préparation de l'inoculum................................................................................... 40 III.1.10.3. Inoculation de la galerie ..................................................................................... 40 III.1.10.4. Lecture et interprétation des résultats................................................................. 41 III.1.11. ANTIBIOGRAMME.................................................................................................... 41 III.1.12. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE (CMI)............... 43 III.1.12.1. Préparation des solutions mères d'antibiotiques................................................. 43 III.1.12.1.1. Méthode de dilution en gélose......................................................................... 43 III.1.12.1.2. Méthode de la microdilution en bouillon ........................................................ 44 III.1.13. TEST DE FORMATION DE BIOFILM (CRISTAL VIOLET – MICROPLAQUE 96 PUITS)...... 45 III.1.14. ISOLEMENT ET EVALUATION FONCTIONNELLE DES BACTERIOPHAGES (ACTIVITE ANTIBACTERIENNE ET ANTIBIOFILM) .................................................................................... 46 III.1.14.1. Principes généraux.............................................................................................. 46 III.1.14.2. Culture bactérienne............................................................................................. 46 III.1.14.3. Isolement des bactériophages............................................................................. 47 III.1.14.4. Protocole de cinétique de lyse en microplaque .................................................. 48 III.1.14.5. Mesure de l'activité antibiofilm des bactériophages........................................... 48 III.1.14.5.1. Préparation de l'inoculum bactérien ................................................................ 48 III.1.14.5.2. Mise en place des conditions expérimentales.................................................. 48 III.1.14.5.3. Incubation et quantification............................................................................. 49 III.1.14.5.4. Calcul du pourcentage de réduction du biofilm............................................... 49 PARTIE IV. RESULTATS ET DISCUSSION................................................................. 50 IV.1. OBJECTIF ................................................................................................................... 51 IV.2. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION ............................................................................... 51 IV.2.1. DENOMBREMENT ET ISOLEMENT DES ISOLATS BACTERIENS...................................... 51 IV.2.2. EXAMEN MICROSCOPIQUE DES ISOLATS.................................................................... 53 Table des matières xiv IV.2.3. CRITERES BIOCHIMIQUES.......................................................................................... 54 IV.2.3.1. Test de la catalase................................................................................................. 54 IV.2.3.2. Test de l'oxydase .................................................................................................. 54 IV.2.3.3. Tests biochimiques conventionnels...................................................................... 56 IV.3. DETERMINATION DES PROFILS DE RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES (ANTIBIOGRAMME)............................................................................................................. 60 IV.3.1. RESISTANCE A L'AMOXICILLINE-ACIDE CLAVULANIQUE (AMC)............................... 61 IV.3.2. RESISTANCE A LA PENICILLINE G (P)........................................................................ 61 IV.3.3. RESISTANCE AU COTRIMOXAZOLE (SXT)................................................................. 61 IV.3.4. RESISTANCE AUX CEPHALOSPORINES (CTX ET CAZ) .............................................. 62 IV.3.5. SENSIBILITE A L'IMIPENEME (IPM) ........................................................................... 63 IV.3.6. SENSIBILITE A LA GENTAMICINE (CN) ET A LA CIPROFLOXACINE (CIP) ................... 63 IV.3.7. PROFILS DE MULTIRESISTANCE (MDR) .................................................................... 63 IV.4. RESULTATS DE LA DETERMINATION DE LA CMI PAR LA METHODE SPOT............... 69 IV.4.1. PENICILLINE G.......................................................................................................... 69 IV.4.2. GENTAMICINE........................................................................................................... 70 IV.4.3. OXYTETRACYCLINE.................................................................................................. 70 IV.4.4. AMOXICILLINE-ACIDE CLAVULANIQUE (AMC)........................................................ 71 IV.4.5. RESULTATS DE LA DETERMINATION DE LA CMI PAR METHODE DE MICRODILUTION EN MICROPLAQUE (AMOXICILLINE) ........................................................................................... 71 IV.5. DISCUSSION DES DISCORDANCES ENTRE L'ANTIBIOGRAMME PAR DIFFUSION SUR DISQUE ET LES VALEURS DE CMI....................................................................................... 73 IV.6. INTERPRETATION DES RESULTATS DE FORMATION DU BIOFILM.............................. 75 IV.6.1. DISTRIBUTION GLOBALE DES PROFILS DE BIOFILM.................................................... 76 IV.6.2. FORTES PRODUCTRICES DE BIOFILM.......................................................................... 77 IV.6.3. PRODUCTRICES MODEREES ....................................................................................... 77 IV.6.4. FAIBLES PRODUCTRICES ET NON PRODUCTRICES ...................................................... 78 IV.6.5. VARIABILITE INTRA-TRIPLICAT................................................................................. 78 IV.6.6. RELATION ENTRE FORMATION DE BIOFILM ET RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES (CORRELATION BIOFILM × RESISTANCE)............................................................................... 78 IV.7. ISOLEMENT ET EVALUATION DE L'ACTIVITE LYTIQUE DES BACTERIOPHAGES ....... 80 IV.7.1. MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE LYTIQUE PAR SPOT TEST...................................... 80 IV.7.2. ANALYSE DES PROFILS DE LYSE PAR SOUCHE ........................................................... 82 IV.7.2.1. Souche KD9 (Serratia sp.)................................................................................... 82 Table des matières xv IV.7.2.2. Souche KM6 (Citrobacter sp.)............................................................................. 82 IV.7.2.3. Souche KA9 (Aeromonas hydrophila)................................................................. 83 IV.8. CINETIQUE DE LYSE BACTERIENNE PAR LES BACTERIOPHAGES (METHODE MICROPLAQUE) ................................................................................................................... 84 IV.8.1. DISPOSITIF EXPERIMENTAL....................................................................................... 84 IV.8.2. RESULTATS PAR SOUCHE .......................................................................................... 85 IV.8.2.1. Souche KA8 (Shigella sp.)................................................................................... 85 IV.8.2.2. Souche KD9 (Serratia sp.)................................................................................... 85 IV.8.2.3. Souche KM6 (Citrobacter sp.)............................................................................. 86 IV.8.2.4. Discussion ............................................................................................................ 86 IV.9. ACTIVITE ANTIBIOFILM DES BACTERIOPHAGES ....................................................... 87 IV.9.1. ANALYSE DES RESULTATS PAR SOUCHE.................................................................... 88 IV.9.2. DISCUSSION.............................................................................................................. 89 PARTIE V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES......................................................... 92 PARTIE VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................... 96 PARTIE VII. ANNEXES................................................................................................ 106 VII.1. ANNEXE 1 MILIEU DE CULTURE............................................................................. 107 VII.1.1.1. Gélose nutritive ................................................................................................. 107 VII.1.1.2. Bouillon nutritif (BN) ....................................................................................... 107 VII.1.1.3. Bouillon Luria-Bertani (LB)............................................................................. 107 VII.1.1.4. Milieu de Clark et Lubs .................................................................................... 107 VII.1.1.5. Eau peptonée ..................................................................................................... 107 VII.1.1.6. Eau physiologique stérile .................................................................................. 108 VII.2. ANNEXE 3 MATERIEL............................................................................................. 108 VII.3. ANNEXES 3 LES ETAPES DE COLORATION DE GRAM............................................ 109 |
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