| Titre : | Contribution à l’étude de l’inhibition de l’activité enzymatique relative des Métallo- Béta-Lactamases par l’extrait des fruits de Phoenix dactylifera (DegletNoor) |
| Auteurs : | Hafsa BOUMEDIENNE, Auteur ; Khedidja NOUARI, Auteur ; HALLA Noureddine, Directeur de thèse |
| Type de document : | texte imprimé |
| Editeur : | Dr. Moulay Tahar Université Saida, Faculté des Sciences Naturelles et de la Vie, 2017/2018 |
| Format : | 114 p. / 29cm |
| Accompagnement : | CD |
| Langues: | Français |
| Langues originales: | Français |
| Catégories : | |
| Mots-clés: | Métallo-beta-lactamase ; Imipenème ; Flavonoïdes ; Phoenix dactylifera ; test CDT |
| Résumé : |
La résistance aux antibiotiques, rapportée de manière croissante dans le monde entier, est le
plus souvent liée à la production de béta-lactamases de type métallo-béta lactamases (MBL) par les bactéries de gram négatif qui hydrolysent tous les béta-lactamines sauf l’aztréonam. Ces enzymes possèdent dans leur site actif un cation indispensable à leur activité qui est invariablement le Zinc. En outre, l’activité de ces enzymes est inhibée par l’addition de chélateur d’ions bivalents (EDTA). La solution pour lutter contre cette menace de résistance serait de trouver des composés qui ont des propriétés chélatrices (tolérable et non toxique sur l’organisme) pour inhiber spécifiquement les MBL. L’objectif de ce travail était de rechercher un éventuel effet inhibiteur de l’activité de métallo-béta-lactamse à partir d’extrait des fruits secs de Phoenix dactylifera. Plusieurs souches ont été prélevées et isolées. Nous avons réalisé le test de CDT (Combined,Disk Test Imipenéme-EDTA) pour sélectionner les souches productrices des MBL. Les souches sélectionnées ont été identifiées par les tests biochimiques. Une semi-purification des MBL a été effectuée pour étudier leur cinétique en absence te en présence de l’extrait de Phoenix dactylifera. Les résultats ont montré que les rendements obtenus de l’extrait méthanolique des fruits secs de Phoenix dactylifera était faible par rapport à l’extrait éthanolique (procynidines-flavonoides) par un taux de 16.4% et 23.2%, respectivement. La comparaison des zones d’inhibition obtenues par le test de CDT a révélé que la souche productrice de métallo-béta-lactamase a enregistré une zone d’inhibition d’un diamètre égale à 12 mm l’imipenème seul et supérieur à 20 mm avec EDTA. Les tests d’identification ont indiqué que lasouche sélectionnée était Cellulomonas spp. Les analyses quantitatives et qualitatives ont montré que l’extrait semi-purifié de béta-lactamases à partir de cette souche est riches en protéines, et son activité enzymatique est sensible à l’EDTA en hydrolysant la pénicilline et la céftazidime. Nous pouvons conclure que une concentration de 1.33 mg/ml de l’extrait des fruits secs de Phoenix dactylifera a pu inhiber non compétitivement l’enzyme (MBL) semi-purifiée à partir de la souche Cellulomonas spp. |
| Note de contenu : |
Introduction 02
Partie I : Synthèse bibliographique I. Généralités sur les β-lactamines 06 I.1. Définition des β-lactamines................................................................................................... 06 I.2. Structure chimique................................................................................................................. 07 I.3. Classification des β-lactamines............................................................................................. 08 I.3.1. Les pénicillines................................................................................................................... 09 I.3.2. Les céphalosporines............................................................................................................ 09 I.3.3. Les carbapénèmes............................................................................................................... 10 I.3.4. Les monobactames............................................................................................................. 10 I.4. Inhibition de β-lactamases 12 I.4. Mode d’action des β-lactamines........................................................................................... 12 I.5. Résistance aux β-lactamines 13 I.5.1 Notion de la résistance bactérienne 13 I.5.2 Types de résistances 13 I.5.2.1 Résistance naturelle 13 I.5.2.2 Résistance acquise 15 I.5 .3. Mécanismes de résistance aux β-lactamines 16 II. Les métallos – β- lactamases 18 II.1. Terminologie et définition 18 II.2. Historique 19 II.3. Classification 20 II.3.1. Principales caractéristiques des MBLs des groupes 3a, 3b et 3 21 II.3.2. Principales caractéristiques des MBLs des sous-classes B1, B2 et B3 21 II.4. Structure moléculaire 22 II.4.1. Structure moléculaire commune 22 II.4.2. Différence de structure 24 II.4.3. Structure du site actif 26 II.5. Mécanisme d'action 28 II.6. Inhibiteurs 29 II.7. Epidémiologie 30 III- Phoenix dactylifera III.1. Présentation de la plante 33 III.2. Position systématique 36 III.3. Composition biochimique 36 III.3.1. Composition biochimique de la partie comestible "Pulpe " 36 III.3.1.1 Constituants majeurs..................................................................................................... 37 III. 3.1.2 Constituants mineurs.................................................................................................... 42 III.3.2. Composition biochimique de la partie non comestible "Noyau "................................... 43 III.4. Effets thérapeutiques des dattes......................................................................................... 44 SOMMAIRE X Partie II : Matériel et méthodes I. Objectifs de l’étude 47 II. Matériel 48 II 1. Matériel végétal 48 II.2. Matériels biologiques 49 II. 2.1. Souches étudiées 49 II.2.2. Milieux de culture 49 II.2.3. Tests biochimiques 49 II.2.4. Matériels utilisés 49 III. Méthodes 49 III.1. Extraction et phytochimie 49 III.1.1. Traitement des échantillons 49 III.1.2. Récolte et séchage 50 III.1.3. Préparation de l’extrait 51 III.1.3.1. Elimination des lipides de l’extrait de plante 51 III.1.3.2. Extraction de flavonoïdes glycosides 53 III.1.3.3. Extraction des procyanidines 53 III.1.3.4. Calcul de rendements 54 III.1..5. Dosage des flavonoïdes 56 III.2. Screening des souches potentiellement sécrétrices des métallo-béta-lactamases 56 III.2.1. Prélèvements 56 III.2.2. Isolement et purification 57 III.2.3. Détection phénotypique de métallo-beta-lactamases par le test CDT 57 III.2.4. Identification 57 III.2.4.1. Les caractères culturaux (examen macroscopique) 58 III.2.4.2. Examen microscopique 60 III.2.4.3. Coloration de Gram 60 III.2.4.5 Tests biochimiques 61 III.2.4.5.1. Oxydase 61 III.2.4.5.2. Catalase 61 III.2.4.5.3. Le test TSI (milieu triple sucres) 62 III .2.4.5.4. Galerie API 20E 63 III.3. Essais d’inhibition de l’activité enzymatique par l’extrait 64 III.3.1. Mise en évidence d’un éventuel effet inhibiteur 64 III.3.1.1. Méthodes de diffusion des disques 64 III.3.1.1 Détermination de la Concentration minimale inhibitrice (CMI) de l’extrait par micro-dilution en milieu liquide 65 III.3.2 Mise en évidence du type d’inhibition 66 III.3.2.1. Extraction semi-purifié de beta-lactamases 66 III.3.2.2. Analyse quantitative des protéines dans les extraits semi-purifiés de beta- lactamases 68 III.3.2.3. Séparation électrophorétique 69 III.3.2.4. La cinétique enzymatique 71 Partie III : Résultats et discussion I. Extraction et phytochimie 73 I.1. Caractéristiques de la matière première (Deglet-Nour) 73 I.2. Préparation de l’extrait 74 I.2.1. couleurs et aspects d’extrait 74 I.3. Rendements d’extraction 74 I.4 Dosage des flavonoïdes 75 II. Screening des souches potentiellement sécrétrices des métallo-béta-lactamases 78 XI II.1. Détection phénotypique de métallo-beta-lactamases par le test CDT 78 II.2. Résultats d’analyses microbiologiques 81 III. Essais d’inhibition de l’activité enzymatique par l’extrait 85 III.1. Détermination de la Concentration minimale inhibitrice (CMI) de l’extrait par micro- dilution en milieu liquide 85 III.2. Mise en évidence du type d’inhibition 86 III.2.1. Analyse quantitative des protéines 86 III.2.2. Séparation électrophorétique 87 III.2.3. Cinétique enzymatique 88 Conclusion 92 Références bibliographiques 95 Annexes 109 XII Tableau Titre Page 01 Classification des bétalactamines 11 02 les résidus d’acides aminés du site actif des trois sous-classes MBLs coordonnés avec les ions du zinc 28 03 Teneur en eau de quelques variétés de dattes de la région Fliache (Biskra) 37 04 Teneur en sucres de quelques variétés algériennes 38 05 Composition moyenne en acides aminés de la datte sèche 39 06 Composition en acides gras de la datte Deglet-Nour 39 07 Teneur en minéraux pour 100 g de pulpe 39 08 Teneur en vitamines pour 100 g de pulpe 40 09 Principaux pigments colorés se trouvant dans les datte 44 10 Caractéristiques physiques de la datte Deglet-Nour 73 11 Diamètre des zones d’inhibitions (mm) par l’imipenème (10μg) seul et en présence d’EDTA (1900μg) de la croissance de bactérie testée. 78 12 Diamètre des zones d’inhibitions (mm) par l’extrait (1500μg) seul ou avec l’imipenème (10μg) de la croissance de la bactérie testée. 80 13 Résultats des tests biochimique Oxydase, Catalase, TSI. 84 LISTE DES TABLEAUX XIII Figure Titre Page 01 Cycle β-lactame 07 02 Structures de β-lactamines 08 03 Structures de quatre principaux groupes de β-lactamines 09 04 Structures d’inhibiteurs de β-lactamases 11 05 Structure monomérique d’une MBL de Aeromonashydrophila(CphA) reconstitué en rubans 25 06 Structure tétramirique d’une MBL de Stenotrophomonasmaltophilia(L1) reconstitué en rubans 25 07 (A) : La structure reconstituée d’une métallo-beta-lactamase de la sous-classe B1, forme Mononucléaire (Bacillus cereusII); (B): schéma du site actif indiquant les acides aminés coordonnés à l’ion de zinc avec leur position 27 08 (A) : La structure reconstituée d’une métallo-beta-lactamase de la sous-classe B1, forme bi-nucléaire (Bacillus cereusII); (B): schéma du site actif indiquant les acides aminés coordonnés au premier et au deuxième ion zinc avec leurs positions 27 09 Schéma réactionnel de l’ouverture du cycle β-lactame 29 10 Epidémiologie mondiale des MBLs 31 11 Noyau et fruit d’une Datte 35 12 Datte et noyau du palmier dattier 35 13 Structure des procyanidines présents dans les dattes 41 14 Structure des flavonoïdes présents dans les dattes 42 15 Photographie de la datte entière Deglet-Nouret ses deux tissus constitutifs 48 16 Photographie de la pulpe de Phoenix dactylifera, avant et après le broyage 50 17 Appareil de Soxhlet 51 18 photographie du Montage de Soxhlet 52 19 photographie du montage de RotaVap 54 20 principales étapes d’extraction de datte 55 21 photographie des différents colonies après l’ensemencement 58 22 schéma générale de la procédure d’isolement, et d’identification des isolats bactériens 59 23 Test de catalaseetTest d’oxydase 62 24 Galerie API20 E 64 25 Schéma d’utilisation de la microplaque 66 26 photographie de préparation de dosage de protéine 69 27 photos de technique d’électrophorèse 71 28 Comparaison des rendements des deux extraits (en% du poids frais) 75 29 Mécanisme de réaction de chlorure d’aluminium avec les Flavonoïdes 77 30 Courbe d’étalonnage de catéchine 77 31 les zones d’inhibitions de la croissance de bactérie testée sur Gélose Mueller Hinton, après 16 à 18 h d’incubation en présence d’imipenème seul (10μg) et d’imipenème (10μg) plus EDTA (1900 μg). IMP= imipenème. 79 32 les zones d’inhibitions de la croissance de la bactérie testée cultivées sur Gélose Mueller Hinton, après 24h d’incubation en présence et en absence d’extrait.d’imipenème seul (10μg) et d’imipenème (10μg) plus extrait de 80 LISTE DES FIGURES XIV Phoenix Dactylifera (1500 μg). IMP= imipenème 33 morphologie macroscopique de la souche étudié sur King B 82 34 l’observation microscopique après coloration de gram. 83 35 Résultats de galerie biochimique(TSI,Catalase,Oxydase) de notre souche 83 36 Résultats de l’identification de la souche par galerie API 20E. 85 37 Droite d'étalonnage tracée en fonction de concentration croissante de BSA(albumine) et les absorbances relatives à 595 nm 87 38 photos de résultats de l’électrophorèse 88 39 Courbe de lineweaver-burk tracées en fonction de l’inverse des vitesses d’hydrolyses de concentrations finales croissantes de céftazidime par l’extrait semi-purifié à partir de cellulomonaseen absence (1.33mg/ml) et en présence (0.66mg/ml) de concentration .de l’extrait de Phoenix dactylifera. 89 |
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